Current Issue

본 연구에서는 강원도 고성 앞바다의 해안가로부터 약 3 km, 해수면으로부터 약 300 m 지점에서 취수한 해양심층수를 사용하여 실험을 수행하였다. 사용한 해양심층수의 초기 염도는 3.4 wt%이며, 역삼투 공정과 감압증발공정을 걸쳐 마그네슘염을 추출하였으며, 제조한 미네랄추출물은 해양수산부 고시 제 2015-112호 ‘해양심층수 미네랄추출물의 정의, 원료기준, 제조·가공기준, 제품규격 및 시험방법’에 적합하며, 미네랄추출물의 정보는 Table 1과 같다.

독성시험은 GLP인증기관인 ㈜크로엔에서 진행하였으며, 시험군으로 Sprague-Dawley 랫드를 사용하였다. 랫드는 다양한 종류의 물질에 대한 독성을 평가하는데 널리 사용되고 있으며, 풍부한 시험 기초자료가 있으므로 본 시험의 실험동물로 선택하였다. 사전시험으로 해양심층수 미네랄추출물(마그네슘염)의 Sprague-Dawley랫드를 이용한 4 주간 반복 경구투여에서 독성학적 변화를 관찰 할 수 없었다. 이에 향후 13 주 반복독성시험의 용량으로 5,000 mg/kg/day 를 최고농도로 하여 설정하는 것이 적절하다고 판단되었다. 시험군은 부형제인 멸균주사용수를 투여하는 대조군, 시험물질 1,250, 2,500 및 5,000 mg/kg/day 투여하는 저용량군, 중용량군 및 고용량군으로 설정하였다. 사용 동물수는 각 투여군 별로 암수 각 10 마리씩 설정하였다(Table 2참조). 관찰기간 동안 일반증상관찰, 체중측정, 사료소비량 측정, 안검사 및 뇨검사를 실시하였고, 관찰기간 종료 후 혈액학 및 혈액생화학적 검사, 절대 장기중량, 상대 장기중량, 부검 시 육안적 검사 및 조직병리학적 검사를 수행하였다(NIFDS[2019]).

시험물질은 전자저울로 칭량하여 용기에 넣고, 부형제를 추가하여 규정농도로 조제하였으며, 조제물의 분석은 한국식품과학연구원에서 Inductively Coupled Plasma Spectrometer, ICP(USA)로 수행하였다. 해양심층수 미네랄추출물(마그네슘염)의 조제물 분석법 벨리데이션 및 안정성 확인시험을 통하여 125 mg/ml 및 500 mg/ml 조제물에 대한 균질성을 확인하였고, 실온 4 시간, 실온 24 시간과 실온 8 일간의 안정성을 확인하였다. 농도 분석은 투여개시전 및 투여 13 주차에 각각의 조제물에 대하여 중층에서 3 회 샘플을 취하여 측정하였다. 농도분석은 한국식품과학연구원에서 실시하였다. 사료는 방사선 멸균된 실험동물용 쥐 사료 Charles River Rat and Mouse 18%(5L79, LabDiet, USA, Lot No.: JUN16171, JUN12173, JUL04173, JUL10173)를 ㈜오리엔트 바이오로부터 공급받아 자유섭취 시켰으며, 제조업체로부터 사료성분 분석 성적서 및 미생물검사 성적서를 받아 시험에 적합한지 확인하였다. 실험동물에 공급되는 물은 폴리카보네이트제 급수병에 넣고 자유섭취 시켰다. ㈜신성생명환경연구원를 통한 정기적 검사(년 1 회)로 “먹는물 수질기준 및 검사 등에 관한 규칙(환경부령 제 684 호 2016 년 12 월 30 일 일부개정)”에 적합한지 확인하였다.

랫드의 검역은 입수 시 모든 동물의 수와 상태를 관찰하였고, 동물공급업체에서 제공한 검사성적서 등을 시험기초자료로 보관하였다. 모든 동물은 동물실 환경에 적응하기 위해 6일의 순화기간을 두었다. 순화기간 동안 모든 동물은 매일 1 회 순화기간 증상을 관찰하였으며, 입수 시와 군분리시 체중을 비교하여 이상이 없고, 순화기간 동안 이상증상이 없는 동물만 시험에 사용하였다. 동물의 군분리는 먼저, 순화기간 중 건강한 개체로 판정한 동물의 체중을 측정하였고, 평균체중의 ± 20 %를 초과하는 동물은 제외하였다. 그리고 선택한 동물들은 순위화 한 체중에 따라 각 군의 평균체중이 최대한 균일하게 분포되도록 지그재그로 분배하여 군분리 하였다. 잔여동물은 군분리 종료 후 시험계로부터 제외시켰으며, 이후 해당 SOP 에 따라 처리하였다. 랫드는 Table 3와 같은 사육환경에서 관리 하였다.

시험물질의 투여경로는 임상예정경로인 경구투여를 선택하였으며, 총 투여량을 1 회/일, 7 회/주, 13 주간 진행하였으며, 15:00 이전에 투여 하였다. 개체별 투여액량은 가장 최근에 측정한 체중을 기준으로 산출하였다. 관찰, 측정 및 검사일은 투여개시일을 Day 1(1 일)로 하고 투여개시일부터 7일간을 Week 1(1 주)로 계산하였다. 모든 동물에 대하여 1 일 2 회(1 일 2 회: 오전 및 오후) 일반증상을 관찰하였다. 관찰은 투여기간동안 모든 동물에 대하여 투여 1 일부터 13 주간 실시하였으며, 관찰기간 중 사망동물은 발견 시 체중을 측정한 후 부검을 실시하였다. 부검 시 장기중량 측정하고 필요 시 조직병리학적 검사를 위해 장기 고정을 실시하였다. 각 측정결과는 통계처리 시 제외하였다. 모든 동물에 대하여, 입수, 군분리시, 투여개시일(투여 전), 투여 개시 후 주 1 회 및 부검일에 체중을 전자저울(GF-2000, AND, Korea)을 사용하여 측정하였다. 투여 13 주차에 군당 각 5 마리의 동물에 대하여 육안으로 눈의 외관을 관찰한 후 양쪽 안구에 산동제(미드리아실 1% 점안액: 트로픽아미드, Alcon a Novartis company, 벨기에, Lot No.: 16B04DN)를 점적하여 동공확장을 유도한 다음, 안저사진기로 전안부, 중간투광체 및 안저를 관찰하였다. 투여 13 주차에 군당 각 5 마리의 동물에 신선뇨(배설 후약 3 시간 이내의 뇨) 및 축뇨(배설 후 약 24 시간 뇨)를 수거하여 뇨화학분석기(CLINITEK Advantus, SIEMENS, Germany)로 검사를 실시하였다. 신선뇨 채취 중에는 투여 및 사료급여를 실시하지 않고, 음수는 자유섭취 시켰다. 뇨량은 주사기 또는 기타 측정도구를 이용하여 육안으로 측정하였으며, 침사는 현미경을 이용하였다. 모든 계획 부검동물은 채혈 전에 하룻밤(약 12 시간 이상)동안 절식(물은 제공)하였다. 부검일에 동물을 Isoflurane (Troikaa Pharmaceuticals Ltd., Lot No.: N0106B17)으로 흡입마취 하였고, 복대동맥에서 주사기를 이용하여 채혈하였다. 모든 계획부검 동물을 대상으로 채혈 후 항응고제(EDTA-2K)가 담긴 채혈 튜브에 넣고, 아래와 같은 항목을 일반혈액분석기(ADVIA 120, SIEMENS, Germany)로 측정하였다. 응고검사는 채취한 혈액 약 1.0 mL을 3.2% sodium citrate 함유 tube에 넣고, 원심분리(3,000 rpm, 10 분, 4 °C)한 후 혈장을 채취하여 응고시간분석기(CA 620, SYSMEX, Japan)로 측정하였다. 모든 계획부검 동물을 대상으로 약 1 mL을 채혈하여 항응고제가 없는 튜브에 담고 상온에서 최소 90 분 이상 방치시킨 후 원심분리(3,000 rpm, 10 분, 4 °C)하여 혈청을 분리하여 아래와 같은 항목을 혈액생화학 분석기(HITACHI 7180, HITACHI, Japan) 및 전해질 분석기(EasyLyte^R PLUS Na/K/Cl ANALYZER, Medica Corporation, U.S.A.)로 측정하였다. 임상병리를 위한 채혈을 실시한 모든 개체는 부검을 위하여 복대동맥 및 후대정맥을 절단하여 방혈/치사 시켰으며, 이후 부검소견을 확인하기 위하여 외관, 두부, 흉강 및 복강의 모든 장기 및 조직을 육안으로 관찰하였다. 대조군, 고용량군 및 사망동물의 고정장기와 부검 시 이상소견이 관찰된 장기 또는 부위에 대하여 조직 슬라이드를 제작하였다. 모수적인 다중비교(parametric multiple comparison procedures)의 경우에는 Levene test 로 등분산성을 검정한 후, one-way ANOVA test 로 유의성을 확인하였으며, 사후검정 시 등분산인 경우에는 Scheffe multiple range test 를, 이분산인 경우에는 Dunnett’s T3-test를 이용하여 대조군과의 유의성을 검정하였다. 통계학적 분석은 상용으로 널리 사용되고 있는 통계 패키지인 SPSS(IBM^R SPSS Statistics, ver. 24)를 이용하여 실시하였으며, P<0.05 인 경우 통계적으로 유의하다고 판정하였다.

본 시험에서는 투여량 설정을 위해 4 주 반복 용량결정시험을 실시한 결과. 고용량인 5,000 mg/kg에서 시험물질에 의한 독성증상이 관찰되지 않아 5,000 mg/kg을 고용량군으로 설정하고 2,500 mg/kg를 중용량군 그리고 1,250 mg/kg를 저용량군으로 설정하였다. 또한 비교를 위하여 대조군을 추가로 설정하였으며, 시험군 및 투여량은 Table 4과 같이 설정하였다.

렛드에 대한 13주 반복 투여 독성시험 주요 임상증상을 Table 5와 같이 요약할 수 있었다. 또한 모든 시험군에서 특이적인 부검소견은 관찰되지 않았으며, 사망한 암수 각 2 마리의 사망개체에서 장조직의 상피세포 괴사소견은 투여물질에 의한 일부개체에서의 소견으로 사료되지만, 기타 암수 대조군과 고용량군의 간과 폐 및 신장에서 관찰된 소견은 랫드에서 자연발생적으로 발생하는 변화이거나, 우발적 또는 산발적으로 나타나는 소견으로 시험물질 투여와 무관한 변화라 사료되어진다. 그리고 해양심층수 미네랄추출물과 원료의 기원이 같은 소금의 경우, 반치사량(LD50, lethal dose for 50% kill)값이 3,000 mg/kg/day 임을 감안할 때 시험물질의 고용량군인 5,000 mg/kg/day에서 발생한 사망개체 수는 일정부분 안전성을 확보했다고 사료되어진다.

제안된 미네랄추출물의 유해 우려항목 위해평가 시 고려한 안전지수는 섭취량 5,000 mg/kg/day에서 일부 독성을 보였으므로 섭취 용량 산정에서 제외하고, 그 다음 섭취량 농도인 2,500 mg/kg/day을 사용하여, 2,500 mg/kg/day ÷ 6.17(rat의 지수) = 405.2 mg/kg/day이며, 안전계수 10을 고려하면 허용수준은 405.2 mg/kg/day ÷ 10 = 40.52 mg/kg/day이며, 한국인 평균체중 60 kg 기준으로 하루 섭취 허용량은 40.52 * 60 kg = 2431.2 mg/day으로 산정 되었다. 기준 설정 시 참고한 값은 WHO(World Health Organization)와 EPA(Environmental Protection Agency) 먹는 물 기준 설정 시 사용한 것들을 이용하였다(Table 6참조).