About Journal of the Korean Society for Marine Environment & Energy

미세조류는 미래의 중요한 대체에너지의 하나로 큰 주목을 받고 있으며, 특히 에너지, 화학, 환경분야를 중심으로 미세조류의 자원화 연구가 활발히 진행되고 있다(Promdaen et al.[2014]; Spolaore et al.[2006]). 근래에는 담수종에 국한되었던 미세조류 자원화 연구가 해수종 미세조류로 확대되면서 관련분야의 연구저변이 점차 확대되고 있는 추세이다(Vandamme et al.[2011]). 미세조류 분석법은 미세조류를 연구하기 위한 기본 수단으로 특히 미세조류의 자원화 연구에 있어서는 미세조류의 형태와 양을 정량적으로 분석하는 절차가 필요하다. 미세조류를 분석하는 방법으로는 계수법, 스크리닝법, 응집법 등이 있다. 첫째, 미세조류 계수법은 Sedgwick-Rafeter(SR) 챔버(Woelkerling et al.[1976]), 헤모사이토미터(Aruoja et al.[2009]), 혹은 플로우사이토미터(Franklin et al.[2001]) 등을 사용하여 미세조류의 개체수 변화를 측정하는 방법이다. 이 측정법은 성장저해검정(Moreno-Garrido et al.[2000]), 선박평형수 평가시험(Holm et al.[2008]) 및 녹·적조 예측 기술(Stumpf et al.[2009]; Johnk et al.[2008])에 주로 사용된다. 둘째, 미세조류 스크리닝법은 플라즈몬 공명장치(Lee et al.[2012]), 수질측정기(Reddy[1981]) 및 GC/MS(Patil et al.[2011])를 사용하여 미세조류의 상태 및 부산물을 측정하는 방법이다. 이 측정법은 바이오 디젤 연구(Mata et al.[2010]), 바이오 케미컬 연구(Williams and Laurens[2010]) 및 이산화탄소전환 균주 연구(Wang et al.[2008])에 사용된다. 셋째, 미세조류 응집법은 분광광도계(Das et al.[2016]) 및 응집분석기(Li et al.[2014])를 사용하여 응집물의 크기 및 개수를 측정하는 방법이다. 이 측정법은 적조 제거제 연구(Lee et al.[2013]; Sengco et al.[2004]) 및 미세조류 수확 방법 연구(Jakob et al.[2016])에 사용된다.

이상의 측정법들 중 미세조류 응집법은 적조 제거제 연구 및 미세조류 수확 연구에 중요하게 활용되지만, 여전히 분광광도계라는 전통적인 광학 측정 방법에 의존한다(Tassinari et al.[2015]). 분광 광도계는 광학밀도(Optical density)를 이용해 시료의 농도를 측정하는 기기이다. 이 기기는 직접적인 계수법에 비해 분석 시간을 단축할 수 있지만, 그 측정의 정확도는 상대적으로 낮아(Shin et al.[2015]; Usov et al.[2001]) 2014년 국내 녹조 예측 시스템인 조류 경보제에서도 분광광도계를 이용한 측정방법이 제외되었다. 더욱이 수 시간 동안 지속적으로 시료를 측정해야 하기 때문에, 측정 시간과 노동력 소모가 클 뿐 아니라, 플록의 상태를 실시간으로 확인 할 수 없는 단점을 가지고 있다. 이를 개선하기 위해 광원 조사에 의한 빛의 반사 정도를 전기적 신호로 검출하는 응집분석기가 개발되어 상용화 되어 있지만, 불순물이 많이 함유되어있는 해양 생태계에선 그 활용성이 크게 제한된다.

렌즈프리 그림자 이미징 기술(lens-free shadow imaging technique, LSIT)은 타겟 세포나 미세입자 등이 가지는 고유의 회절패턴 혹은 그림자 이미지를 Complementary Metal Oxide Semi-conductor(CMOS) 또는 Charge Coupled Device(CCD) 이미지 센서 등의 광전자소자를 이용하여 획득하고, 실시간으로 분석하여 타겟 물질의 상태 정보를 분석하는 기술이다(Fig. 1). 특히, 혈액 및 동물 세포계수(Seo et al.[2008]; Stybayeva et al.[2010]), 동물 세포 활성도분석(Jin et al.[2012]), 혈색소 농도 검출(Kim et al.[2011]), 세균막농도 검출(Kwak et al.[2014]), 병원성 세균 농도 검출(Lee et al.[2014]) 등에서 그 효용성을 입증하였다. 이 기술은 시스템을 구성할 때 현미경 등에서 사용되는 고가의 광학 렌즈가 필요하지 않음으로, 저가의 측정 장비로 개발 가능한 장점을 가지고 있다. 또한 렌즈 없이, 저가의 Light Emission Diode(LED)와 CMOS 이미지 센서 만으로 시스템을 구현하기 때문에 넓은 시계(Field Of View, FOV)를 확보할 수 있다(Ozcan and Demirci[2007]). 통상 5백만화소 1장의 CMOS 이미지 센서 그림자 이미지로 100배 배율의 현미경 기준 50배에 해당하는 시계를 확보할 수 있으므로 고처리량의 측정 기술이다(Roy et al.[2015]).

Fig. 1. 
(a) Principle of lens-free shadow imaging technique (LSIT), (b) example of LSIT image, and (c) its 3D digital expression.

본 연구는 렌즈프리 그림자 이미징 기술 기반의 미세조류 모니터링 플랫폼을 제안한다. 이를 통해 단일 미세조류 및 응집 미세조류의 실시간 분석을 현미경 매칭 이미지와의 비교를 통해 입증한다. 본 플랫폼을 이용하면 별도의 배율 조정이나 초점을 맞추는 과정 없이 단일 미세조류와 응집 미세조류를 동시에 분석할 수 있다. 또한, 천연 응집제를 사용해 미세조류의 응집실험을 진행하며, 실시간으로 미세조류의 이미지를 확보하고 분석 가능함을 보인다. 특히, 자체 개발한 미세조류 분석 프로그램을 사용하여 플록들의 개수, 플록들의 유효면적, 최대크기 플록의 면적을 정량적으로 분석하였다.

본 연구에서 궁극적으로 목표로 하고 있는 미세조류의 응집 현상을 렌즈프리 그림자 이미지 기술을 이용하여 실시간으로 분석하기 위한 사전 단계로, 단일 미세조류를 해당 방법을 통해서 측정이 가능함을 확인하는 실험을 진행하였다, 단일 미세조류를 관찰하기 위해서는 일반적으로 현미경을 이용한 분석방법이 사용되므로, 본 연구팀은 동일한 영역의 미세조류를 렌즈프리 그림자 이미징 기술과 현미경을 이용하여 획득한 각각의 이미지들의 유사성을 비교하였다.

이를 위해 Fig. 3(a)의 왼쪽 그림과 같이, 단일 미세조류 시료의 그림자 이미지를 촬영하고, 일부 영역을 확대하여 동일한 영역에 해당되는 현미경 이미지를 비교하였다. 영역 1과 영역 2를 400배의 현미경으로 촬영한 이미지에는 세 개의 미세조류를 확인할 수 있으며, 영역 1과 영역 2를 확대한 그림자 이미지 역시 세 개의 그림자 이미지를 확인할 수 있다. 두 이미지를 비교하면 미세조류의 그림자 이미지가 나타난 위치에 정확하게 미세조류의 현미경 이미지가 위치하고 있음을 확인할 수 있다. 이를 통해 그림자 이미지로 단일 미세조류를 측정할 수 있음을 알 수 있다.

Fig. 3. 
Whole frame LSIT image for microalgae and magnified regions-of-interest with matching standard optical micrographs. (a) single microalgae condition, (b) flocculated micro algae condition.

두 번째로 단일 미세조류들이 응집된 상태를 그림자 이미지를 통해서 관찰할 수 있는 가능성을 확인하기 위해서, Fig. 3(b)와 같이 단일 미세조류들이 응집되어 플록이 형성된 미세조류의 그림자 이미지와 현미경 이미지를 비교하였다. Fig. 3(b)의 왼쪽 그림에 해당되는 그림자 이미지의 영역 3을 50배 현미경으로 촬영한 현미경 이미지에서는 3개의 거대 플록을 확인할 수 있으며, 영역 3을 확대한 그림자 이미지 역시 3개의 거대 플록 이미지를 확인할 수 있다. 이들을 비교해 보았을 때, 두 이미지에서 볼 수 있는 플록의 위치와 형태는 서로 유사하므로, 이를 통해 그림자 이미지로 플록이 형성된 미세조류를 측정할 수 있음을 알 수 있다. 이와 같이, 미세조류의 그림자 이미지와 현미경 이미지의 비교실험을 통해서, 렌즈프리 그림자 이미징 기술로 단일 미세조류부터 응집되어 플록이 형성된 미세조류까지 별도의 배율 변화 없이 측정이 가능함을 확인하였다.

세 번째로 본 연구에서 최종 목표로 하고 있는 렌즈프리 그림자 이미징 기술을이용하여 실시간 변화하는 미세조류의 응집 현상을 측정하기 위하여, 시간에 따라 응집 현상이 진행되는 미세조류를 그림자 이미지로 촬영하는 실험을 진행하였다. 응집 현상이 진행되는 미세조류의 그림자 이미지는 22 분간 총 5회 촬영하였으며(0 분, 2 분, 7 분, 12 분, 22 분), 미세조류의 응집을 위해서 천연 생물응집 제인 TB-EPS를 사용하였다.

Fig. 4(a)는 응집제를 투입하지 않은 미세조류 시료(버퍼액 투입, 대조군)와 TB-EPS 응집제를 투여한 미세조류 시료(TB-EPS 투입, 실험군)를 시간 변화에 따라 촬영한 그림자 이미지이다. 촬영된 대조군 이미지에서는 시간이 지남에 따라 육안으로 구분이 어려운 작은 미세조류 플록들이 형성되는 것을 볼 수 있다. 반면 촬영된 실험군 이미지에서는 시간이 지남에 따라 육안으로도 확인하기 쉬운 큰 미세조류 플록들이 형성되는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 TB-EPS가 미세조류의 응집 실험에서 응집제로 유용함을 알 수 있다. 육안으로 확인된 미세조류의 응집 현상의 정도를 정량적으로 분석하기 위해서 본 연구에서는 그림자 이미지를 이용한 미세조류 응집 분석 프로그램을 제작하였다. 미세조류 응집 분석 프로그램은 상용 계산프로그램인 Matlab^®(MathWorks^®, 미국)의 영상분석라이브러리를 이용하여 제작되었다. 미세조류 응집 분석 프로그램은 그림자 이미지에 포함된 플록을 검출하는 역할을 한다. 플록 검출은 단일 미세조류의 그림자 이미지가 두 개 이상 중첩된 위치를 플록으로 인식하여 플록의 테두리를 붉은색으로 표시한다. 플록 분석은 검출된 플록들의 개수(Number of flocs)와 검출된 플록들의 영역(붉게 표시된 테두리), 내부의 픽셀 수(유효면적, effective area of flocs), 그리고 검출된 플록 중 가장 큰 플록의 픽셀 수(최대크기 플록의 면적, maximum size of floc)의 결과를 보여준다.

Fig. 4. 
Comparison between microalgae detection results. (a) Comparison between control sample and TB-EPS treated sample, (b) Whole frame LSIT image at t=0, (c) Same image at t=22 min.

Fig. 4(b)는 실험군 시료의 초기(0 분) 그림자 이미지다. 해당 그림자 이미지를 미세조류 응집 분석 프로그램을 통해 플록 분석을 진행한 결과, 검출된 플록들의 개수는 14개, 검출된 플록들의 유효 면적은 3,595 픽셀이며, 최대 플록의 면적은 472 픽셀이라는 것을 확인할 수 있다.

Fig. 4(c)는 22 분의 응집 과정 후 촬영된 실험군 시료의 그림자 이미지이다. 미세조류 응집 분석 프로그램의 플록 분석을 통해 검출된 플록의 개수는 52개, 검출된 플록들의 유효 면적은 124,312픽셀이며, 최대 크기의 플록의 면적은 14,279 픽셀임을 알 수 있다. 해당 실험을 통해서 그림자 이미징 기술로 미세조류 응집 현상을 실시간으로 촬영하고, 촬영된 그림자 이미지를 프로그램으로 통해 정량적으로 분석이 가능함을 확인하였다. 특히 플록 분석의 결과값은 세 가지의 분석 결과들(플록들의 개수, 플록들의 유효면적 및 최대크기 플록의 면적)을 제공함으로 해당 파라미터들을 통해서 미세조류의 응집 정도를 분석할 수 있다.

마지막으로 앞선 실험을 통해 미세조류의 플록 분석 가능성이 입증된 렌즈프리 그림자 이미지를 이용한 미세조류 분석 프로그램을 이용하여 3종의 응집제에 따라 서로 다르게 변화하는 미세조류 플록 응집 현상의 차이점을 분석하는 실험을 진행하였다. 해당 실험에 사용된 응집제는 S-EPS, LB-EPS, TB-EPS이며, 실험은 급속교반전(0 분) 1번, 급속교반 후(2 분) 1번, 완속 교반 중 4번(7 분, 12 분, 17 분, 22 분)으로, 총 22 분 동안 6번의 그림자 이미지를 실시간으로측정하여 플록의 변화를 확인하는 방법으로 진행되었다. 응집제의 투입 여부와 응집제에 따라서 플록 생성에 영향을 미치는 정도를 확인하기 위해서, 시간대별로 촬영한 6개의 그림자 이미지를 이용하여 앞서 설명한 미세조류 분석 프로그램을 통해 세 가지 파라미터(플록들의 개수, 플록들의 유효면적 및 최대크기 플록의 면적)의 시간에 따른 변화량을 분석하는 방법으로 실험을 진행하였다.

Fig. 5(a)는 미세조류 시료에 응집제를 투입하지 않은 경우와 3종의 응집제를 투입한 경우, 시간에 따라 변화하는 미세조류의 응집 현상을 렌즈프리 그림자 이미지의 미세조류 분석 파라리터 중 하나인 최대 크기를 갖는 플록의 면적값으로 표현한 그래프이다. 해당 그래프를 살펴보면 LB-EPS를 투여한 시료에서 최대 크기를 갖는 폴록의 면적이 시간이 지남에 따라서 가장 크게 증가하며, 응집제를 넣지 않은 대조군 시료에서의 시간에 따른 최대 크기 플록면적의 변화량이 가장 작은 것을 확인할 수 있다. S-EPS를 투여한 시료의 시간에 따른 변화량은 대조군 시료의 경우보다 3배 이상 크지만, 대조군 시료와 유사하게 전체적인 변화량은 작은 것을 확인 할 수 있다. 반면, TB-EPS를 투여한 시료의 최대 크기 플록 면적의 변화량은 LB-EPS를 투여한 시료의 경우에 비해 절반이지만, S-EPS를 투여한 시료의 경우에 비해서는 4배 이상 큰 것을 알 수 있다. 이를 통해 LB-EPS가 다른 두 가지의 응집제들에 비해서 면적이 가장 큰 플록을 형성시키는 효율이 가장 크다는 것을 미세조류 그림자 이미지의 최대 크기 플록의 면적값 비교를 통해서 정량적으로 분석 할 수 있다.

Fig. 5. 
Results of floc analysis parameters. (a) The maximum size of floc of microalgae by flocculation at different time, (b) The effective area of flocs of microalgae formed by flocculation at different time, (c) The number of flocs of microalgae by flocculation at different time.

Fig. 5(b)는 미세조류가 응집되어 형성된 플록들의 유효 면적의 변화를 시간에 따라 나타낸 그래프이다. 해당 결과를 보면 응집 실험을 마친 22 분 후의 S-EPS를 투여한 시료의 유효 면적은 42,511픽셀로 대조군 시료의 값인 36,813 픽셀보다는 크지만 차이가 크지 않은 것을 알 수 있다. 반면 LB-EPS를 투여한 시료의 22 분 후의 플록 유효 면적은 102,518 픽셀로 대조군 시료와 S-EPS를 투여한 시료의 경우와 비교하여, 2배 이상의 변화폭을 보인다. TB-EPS를 투여한 시료의 22 분 후 플록 유효 면적은 124,312 픽셀로 다른 조건의 시료들의 경우에 비해 가장 큰 값을 보이며, 측정한 지 12 분이 지난 시점부터 LB-EPS를 투여한 시료보다 유효 면적이 커지는 것을 확인할 수 있다.

Fig. 5(c)는 3종의 응집제를 투입하여 시간에 따라 변화하는 미세조류 플록의 수를 나타낸 그래프이다. 해당 실험 결과를 보면 대조군 시료나 S-EPS를 투여한 시료의 경우, 응집 실험이 진행되는 동안 전체적으로 플록의 수가 증가하는 경향을 갖는 것을 볼 수 있다. 반면 플록 분석 파라미터인 최대 크기의 플록 면적과 플록들의 유효 면적에서 시간에 따라 큰 증가추세를 보였던 LB-EPS와 TBEPS를 투여한 시료들은 각각 2 분, 12 분 후부터 플록 수가 감소하는 것을 확인할 수 있다.

앞서 제안된 세 가지 플록 분석 방법을 종합적으로 해석해보면, 플록의 수가 일정시간 증가한 후 감소 추세를 보이는 시료는 최대크기를 갖는 플록의 면적과 플록들의 유효면적의 증가 폭이 클 것으로 예상할 수 있다. 이는 단일 미세조류들이 반응 초기에는 크기가 작은 플록을 형성하고 시간이 지남에 따라서 작은 플록들이 서로 응집하면서 점차적으로는 하나의 거대한 플록을 형성하기 때문이다. 초반에 생성된 작은 플록들로 인해서 플록의 수가 증가하지만 시간이 지남에 따라서 그 플록들이 서로 응집되어 전체의 플록숫자는 감소하고, 최대 반응기에 도달할 경우 플록의 숫자는 작지만 단일 플록의 크기는 크고 유효 면적이 큰 플록이 형성된다는 의미이다. 반면, 플록 수가 지속적으로 증가 추세를 보이는 시료는 최대 크기의 플록 면적과 플록들의 유효 면적의 증가 폭이 작을 것이라 예상할 수 있으며, 이는 해당 미세조류는 아직 거대 플록으로 성장할 수 있는 조건이 갖추어 있지 않음으로 해석할 수 있다.

이런 분석들을 토대로, 미세조류에 적용되는 응집제의 영향을 실시간으로 유추해 볼 수 있다. 이는 침전 속도로 응집제의 성능을 평가하는 기존의 측정 분석 방법들에 비하여, 응집제가 미세조류에 미치는 영향력에 대한 다양한 정보를 줄 수 있을 것이라 판단된다.

본 논문에서는 렌즈프리 그림자 이미징 기술을 이용하여 미세조류의 응집 현상을 실시간으로 분석할 수 있음을 실험을 통해서 확인하였다. 우선 렌즈프리 그림자 이미지를 이용하여 단일 미세조류의 측정과 응집 미세조류 측정이 동시에 가능함을 현미경 이미지와의 비교를 통해 입증하였다. 또한 본 연구팀이 개발한 미세조류 분석프로그램을 통하여 미세조류의 응집 현상을 정량적으로 분석할 수 있는 세 가지의 파라미터(플록들의 개수, 플록들의 유효 면적, 최대 크기 플록의 면적)를 제안하였다. 해당 파라미터의 유효성을 입증하기 위해서 응집 효율이 다른 응집제인 S-EPS, LB-EPS, TBEPS를 이용하여 시간에 따라 다른 응집 현상을 보이는 미세조류의 응집 상태를 제안한 파라미터들을 이용하여 분석하였다. 해당 실험결과를 통해서 본 연구에서 제안한 미세조류 분석 파라미터들이 응집된 미세조류의 상태를 대표적으로 나타낼 수 있음을 확인하였다. 상기한 연구결과들을 통해서 렌즈프리 그림자 이미징 기술을 이용하여 미세조류 응집 현상을 실시간으로 분석이 가능함을 증명하였으며, 이를 통해서 제안한 방법이 새로운 미세조류 분석 기술로 적용할 수 있을 것이라 기대한다.