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이산화탄소(CO₂)는 지구온난화(global warming)의 주범으로 인식되면서(IPCC[2001]) 이산화탄소 배출량을 감소하기 위해 국제적인 협약 및 제제 방안들이 활발히 진행되고 있다. 그중 대규모 배출원으로부터 이산화탄소를 회수하여 장기간 격리시키는 탄소 포집 및 저장(carbon dioxide capture and storage; CCS)기술은 이산화탄소 저감에 있어 현실적인 사업으로 인정받아 추진되고 있다 (IPCC[2005]; Herzog[2001]). 국내에서도 역시 이산화탄소 포집과 저장 기술 연구에 대한 관심과 국가적인 재정 지원이 크게 증가하고 있으며, 이산화탄소의 해양 지중저장 과정 또는 이후 발생할 수 있는 해양 유출에 대해 효율적인 관리방안의 구축에도 많은 노력을 기울이고 있다(강성길[2006]). 특히 최근 국제해사기구(IMO)에서 승인된 해저 지중저장을 통한 이산화탄소 격리는 빠른 시일 내에 현실화 가능한 사업으로 인정받아 추진되고 있다. 하지만 해양 또는 지중저장 기술들이 이산화탄소를 일시적으로 제거하는 효과는 크지만 해양환경 및 생태계에 부정적인 영향을 미칠 수 있다는 점에서 우려를 낳고 있다(Seibel and Walsh[2001]). 따라서 대기중 이산화탄소 저감을 위한 사업의 일환으로 해양 또는 지중저장 처리를 할 경우 생태계 영향을 최소화할 수 있는 처리 조건을 모색하는 것이 바람직 할 것이며(IPCC[2001]), 이산화탄소로 인한 물리 화학적 변화가 해양생물에게 미치는 피해를 정확하게 파악하고 정량적으로 평가할 수 있는 기법 개발이 필요하다(Kita and Ohsumi[2004]).

이산화탄소로 인해 산성화(acidification)된 표층 해수 또는 이산화탄소 심해 저장과정에서 유출되어 나타나는 심해 pH 감소는 해양생물의 세포막 기능, 특히 이온교환 등에 악영향을 줄 수 있으며(Knutzen[1981]), 이산화탄소 자체가 생물에 흡수되어 세포내 pH 감소와 생화학적 특성 및 기능에 부정적인 영향을 미칠 수 있다(Pörtner[2008]). 산성화된 해수가 생물에게 미치는 영향을 살펴보면, 해산 갯지렁이인 Nereis virens는 pH 6.5이하에 10일간 노출될 경우 생존율과 굴착(burrowing activity)기능이 저해되고 glycogen이 감소되는 영향이 있는 것으로 보고되었다(Batten and bamber[1996]). 해산 이매패류는 pH 7이하부터 생존율, 성장률 그리고 먹이 섭취율이 감소한다는 연구결과가 실험적으로 밝혀진바 있다(Bamber[1990]).

본 연구에서는 해양으로 유입된 고농도의 이산화탄소가 해저 생물에게 미치는 영향을 파악하기 위해 저서 무척추동물인 두토막눈썹참갯지렁이(Perinereis aibuhitensis, 이하 청충)를 이용하여 세포내 에너지 할당 변화(Cellular Energy Allocation; CEA)를 통한 독성학적 영향을 규명하고자 하였다. CEA는 생물의 세포 수준에서 일어나는 여러 가지 과정에서 흡수된 에너지의 양과 소비되는 에너지의 양 사이의 양적 균형이 어느 정도 이루어지고 있는지를 평가하는 값이다. CEA는 급성 독성 반응이 일어나는 시간보다 짧은 기간의 노출에서도 그 영향이 나타나는 것으로 보고되어 있어 측정에 투입되는 노력이 만성독성 실험보다 적다는 장점이 있다(De Coen and Janssen[1997]; [2003]). De Coen and Janssen[2003]은 담수산 물벼룩인 Daphnia magna를 이용한 실험을 통하여 CEA가 급성 영향이 나타나는 수준보다 훨씬 낮은 수준에서 반응을 나타내고 있으며, 독성물질 농도에 대한 개체군 성장률(intrinsic rate of population increase)의 반응과 유사한 농도범위에서 반응이 나타남을 보였다. 이 때, CEA는 48-96시간의 비교적 짧은 기간의 실험으로 측정한 결과이며 개체군성장률은 21일 동안의 장기간 노출에 의한 결과이다. CEA는 실험실 외 현장 서식생물에도 적용 가능하다. 지중해담치를 대상으로 대조지역과 서식지역 개체간 CEA를 비교하여 오염의 정도파악 등 in situ biomarker로도 활용되고 있다(Erk et al.[2011]). CEA 분석은 현재까지 국내에서 많이 시도되고 있지 않지만, 향후 현장노출 생물 또는 실험실 노출생물의 생화학적 영향을 파악할 수 있는 독성 지표로 그 이용 가치가 높을 것으로 사료된다.

해수 중 이산화탄소 농도 증가로 인한 생물의 세포 내 에너지 할당 변화를 관찰하기 위해 이용한 청충(P. aibuhitensis)은 2010년 11월 인천연안에서 채집된 것을 이용하였다. 채집된 청충은 아이스박스에 담아 실험실로 운반하였으며, 실험실에서 육안으로 각 개체를 검사하여 상처를 입은 개체는 제거하고, 건강한 개체만을 선별하여 2주 이상 실험실 환경에 순치시켰다. 순치는 55×150×10 cm 크기의 사각형 아크릴수조에 오염되지 않은 퇴적물을 3 cm 두께로 깔아주었으며, 그 위에 0.1 μm로 여과된 해수를 퇴적물 위에 약 2 cm 높이로 채워 23 ℃ 조건의 항온실에서 순치하였다. 순치에 사용한 퇴적물은 인천 영종도 연안에서 채취한 퇴적물로 300 μm 표준체를 통과시켜 굵은 입자와 내서 생물을 제거하여 사용하였다. 순치 환경조건은 ‘해산 갯지렁이 자원조사 및 사육기법 개발’(MST[1991])을 참고하였다.

해수 중 용존 이산화탄소의 증가가 청충의 세포내 에너지 할당 변화에 미치는 영향을 알아보기 위해 4개의 CO2 농도구배, 즉 0.39 (대조구=390 ppmv), 3.03 (=3,030 ppmv), 10.3 (=10,300 ppmv), 그리고 30.1 (=30,100 ppmv) mM의 합성기체를 연속적으로 폭기한 해수에 청충을 7일간 배양한 이후 세포내 에너지 할당 변화를 측정하였다. 본 연구에서는 대조구를 제외한 이산화탄소 최고 농도(30.1 mM High), 중간 농도(10.3 mM Medium) 그리고 낮은 농도(3.03 mM Low)로 각 3배의 농도차이를 두었으며 이는 선행연구(Sung et al.[2010])의 결과를 추가적으로 고려한 것이다. 각 이산화탄소 농도구는 CO₂ 혼합 가스(용기압력: 20 ℃ 10 MPa; (주)에어코리아)는 공기와 순수 이산화탄소를 혼합하여 조제하였으며, 각 농도별 가스 조성비를 측정하여 이산화탄소 농도를 확인하였다. 여기서 0.39 mM의 이산화탄소는 대기중 일반적으로 나타나는 농도이며(Gentzis[2000]), 본 연구에서는 이를 대조구로 이용하였다. 이산화탄소 합성기체는 대부분이 공기이고 이산화탄소는 최대 3%이기 때문에 수중 용존산소는 실험기간 중 90% 이상을 유지하였다.

증가된 용존 이산화탄소에 대한 노출실험은 U.S. EPA[1990]에서 제시된 표준독성시험법을 참고하였다. 노출실험은 20±1 ℃ 조건의 항온배양기 안에 가스가 일정속도로 주입되는 가스 챔버(gas chamber)에서 이루어졌고, 노출 용기로는 1-L 유리비커를 사용하였다. 노출실험에 사용된 퇴적물은 순치에 사용된 퇴적물과 동일하며, 1-L 유리비커에 200 mL씩 넣어주었다. 자연해수는 인천시립 수산종묘배양연구소에서 공급받아 0.1 μm 필터를 통과시킨 후 750 mL씩 넣어주었다. 노출시험 전에 이산화탄소 가스를 해수에 폭기시킨 후 pH 변화를 주기적으로 모니터링 하였으며, 평형상태에 도달할 때까지 폭기하였다. 그 결과 주입 가스의 이산화탄소 농도가 높아 질수록 pH가 뚜렷이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 먼저 이산화탄소를 폭기하기 전 자연해수의 pH는 7.88±0.01로 측정되었으며, 대조구(0.39 mM)로 순수 공기만을 주입한 실험구의 pH는 8.18±0.0.3으로 측정되었다. Low, Medium 그리고 High 실험구에서의 pH는 7.53±0.02, 7.04±0.0.2 그리고 6.62±0.0.3으로 각각 측정되었다. 실험기간동안 측정된 염분과 암모니아성 질소의 평균값은 각각 30.9±0.5 psu, 40.0±3.6 mg/L 이었다(Table 1).

생물노출은 각 비커에 2개체씩 노출하였으며 실험구당 반복구는 3개로 설정하여 1 농도 당 6개체가 노출되도록 하였다. 이산화탄소 혼합가스는 노출이 끝날 때 까지 지속적으로 폭기하였고, 먹이는 공급하지 않았다. 노출 종료 후 청충을 수거하여 생존여부를 관찰한 결과 모든 실험구의 개체가 생존한 것을 볼 수 있었고, 생존 개체는 깨끗한 여과해수로 옮겨 체내 퇴적물을 배설하도록 하였다. 체내 퇴적물을 모두 배설한 개체는 액체질소에서 급속 냉동한 후 CEA를 분석하였다.

본 연구에서는 먹이공급이 없는 실험조건에서 시간이 지날수록 생물의 에너지 보유량은 점진적으로 낮아지고 이산화탄소에 의한 스트레스에 의해 가속될 것이라는 가설을 세웠다. 여기서 노출 과정 중 섭식하는 퇴적물에 의한 에너지 보유량은 고려되지 않았다. CEA가 낮아지는 것은 세포내 에너지 함량이 낮아지거나, 에너지 소비가 증가하는 현상에 기인한다. 먹이활동을 통하여 획득한 에너지를 기본적인 대사에 이용하고 남은 에너지가 저장물질로 변환되어 생물의 성장에 이용되는데, 스트레스가 체내 항상성 유지에 에너지 소비를 증가시켜 결과적으로 CEA가 낮아지는 현상은 물벼룩(Soetaert et al.[2007]), 단각류(Olsen et al.[2007]; [2008]), 이매패류(Smolders et al.[2004]; Olsen et al.[2007]), 복족류(Moolman et al.[2007]), 다모류(Macrae[2009]; Stomperudhaugen et al.[2009]), 어류(Smolders et al.[2003]), 곤충류(Bagheri et al.[2010]), 해산 곤쟁이류(Verslycke and Janssen[2002]; Verslycke et al.[2003]; [2004a]; [2004b]) 등의 연구결과에서 나타나고 있다.

고농도의 이산화탄소에 청충을 7일간 노출한 결과 생존에는 영향이 없었으나, 농도가 증가 할수록 세포내 에너지 할당이 급격히 감소하는 경향을 볼 수 있었다. 세포내 에너지 할당 변화에 미치는 주된 요인은 당질과 단백질 함량 감소였으며, 세포의 에너지 소비율(E_c) 증가 또한 결과적으로 CEA 감소로 나타났다. 청충 체내의 에너지 조성 변화는 이산화탄소 농도가 증가함에 따라 지질의 소비보다 단백질의 소비가 크게 늘어난 것이 원인으로 작용되었다. Vandenbrouck[2009] 연구에서는 니켈(Ni)이온에 대한 물벼룩의 CEA 분석결과 단백질의 소비보다 지질의 소비가 크게 증가한 결과를 보고하였다. 이는 본 연구결과와 상반되는 결과이지만 생물의 영양단계, 즉 종에 따라 외부스트레스에 대응하는 전략 및 기전이 다르기 때문에 에너지 함량과 조성 또한 달라지는 것으로 판단된다. 청충은 하루에 체중 1 g 당 약 100 mg의 퇴적물을 섭취하는 것으로 보고된 바 있으며(MST[1991]) 노출기간 중 지질함량의 유지는 퇴적물에 포함된 유기물질 섭취로 인한 에너지로 추정할 수 있다. 퇴적물 내 유기물질 함량이 높거나 퇴적물 성상이 니질일 경우 갯지렁이의 체내 유기질함량은 증가한다(Longbottom[1970])는 연구결과를 볼 때 본 연구에서 나타난 결과가 같은 경향을 보임을 알수 있다. 본 연구에서는 각 실험구별로 동일한 퇴적물을 사용하였기 때문에 퇴적물 성상 차이로 인한 청충 체내 에너지함량 증가 또는 감소 영향은 실험구별로 차이가 매우 적을 것으로 판단된다. 이산화탄소 농도별 청충 체내 지질함량은 Low부터 대조구 대비 유의한 수준의 증가가 나타났으며 Medium에서는 Low와 유사한 수준이었고, High에서는 다시 증가하였다. 이산화탄소로 인한 해수의 화학적 변화가 청충의 지질함량 변화에 미치는 영향연구는 국내·외적으로 없기 때문에 비교는 불가능 하였다.

당질, 단백질, 지질은 생물체를 구성하는 대표적인 저장물이며, ETS 활성은 세포내 미토콘드리아에서 산소를 소비하는(세포내 호흡) 시스템이다. 즉, 흡수된 에너지 중 여러 가지 대사를 통하여 소비되는 에너지의 양을 나타내는 지표이다. 본 연구에서도 E_c가 High에서 보다 Medium에서 더 높게 나타났다. ETS 활성은 아가미 혹은 폐 등의 호흡기관에서 산소교환율(호흡률)과 밀접한 상관관계가 있다(Packard et al.[1996]). 어류는 수온이 증가하거나 수중에 용해된 암모니아농도가 증가함에 따라 산소 소비율이 증가하는 것으로 보고되었다(Mitsunaga et al.[1999]; Smart[1978]). 또한 독성 물질이 아치사의 농도로 노출되면 호흡률이 증가하는 현상이 나타나지만, 치사농도에 근접하는 농도에서는 오히려 호흡율이 감소하는 것이 실험적으로 밝혀진바 있다(NRF[2004]).

물벼룩을 카드뮴에 48, 96시간 노출하였을 때 농도가 증가함에 따라 에너지 소비가 감소하는 영향이 나타났다(De Coen and Janssen[1997]; [2003]; Soetaert et al.[2007]. 반면, 해산 곤쟁이류가 유해화합물질에 일정기간 노출되었을 때 농도 증가에 따라 에너지 소비가 증가하는 것으로 보고되었다(Verslycke et al.[2004a]; [2004b]). 독성물질이 생물에게 노출되는 정도에 따라 에너지 소비율이 다르게 나타나는 것은 아직까지 독성 메카니즘이 명확히 규명되지 않았다. 하지만 생물의 ETS 활성을 이용한 세포 에너지 소비율 평가는 생물의 성장과 밀접한 관계가 있기 때문에 생물영향을 측정하기에 좋은 지표가 될 수 있을 것으로 판단된다.

스트레스로 인한 세포내 변화는 세포내로 유입된 이산화탄소로 인해 세포내부가 산성화되면서 효소활성을 저해시키고, 항상성기작에 의해 중탄산염 이온교환 등에 에너지를 사용함으로써 보유에너지 감소가 나타난 것으로 추정된다. 또한 생물노출 실험에서 이산화탄소를 주입한 후 평형상태에 도달하였을 때 생물을 노출하였기 때문에 급격한 pH 변화가 세포수준 또는 각 기관들까지 손상을 입혀 정상적인 대사과정이 이루어지지 않았거나 회복에 더 많은 에너지를 할당 한 것으로 판단된다(Seibel and Walsh[2001]). Lee et al.[2006]에서는 이산화탄소로 산성화시킨 해수에 해양발광미생물과 단각류를 노출한 결과 해양발광미생물의 경우 pH 5.7 그리고 단각류는 pH 6.4 이하에서 영향이 관찰되었으며, Sung et al.[2010]에서는 해양발광미생물을 이산화탄소에 12시간 노출한 결과 3,000 ppmv (pH 7.4)부터 저해 영향이 나타난 것으로 보고하였고 Kurihara & Shirayama[2004]에서는 pH 7.6 수준에서의 성게 발생 영향을 보고한 바 있다. 그리고 Berge et al.[2006]에서는 이매패류의 성장 저해가 pH 7.1부터의 영향을 보고하였다. 이를 본 연구결과(pH 7.53)와 비교하면 CEA 평가기법이 매우 민감한 수준에서 반응이 나타남을 알 수 있다.

본 연구에서 이용한 CEA 평가기법은 분석시간이 비교적 짧으며 민감한 특징을 갖고 있어, 환경 스트레스로 인한 생리적 반응을 나타내는 지표로 지금까지 널리 사용되어왔던 성장잠재력(scope for growth)을 대신할 수 있는 지표(Smolders et al.[2004])로 이용될 수 있을 것이다. 하지만 현장 시료의 독성평가나 유해화합물질이 생물에게 미치는 영향 그리고 현장이식실험에 대한 연구사례는 아직 많지 않은 편이며, 평가방법이 아직까지 명확히 규명되지 않았다는 단점이 있다. 곽 등[2008]에서는 CEA 시험법의 오차를 줄이기 위한 선행연구가 수행되었으며, 시험법에 관한 표준지침서가 제시되어있다. CEA는 실험실 평가 또는 현장적용평가 모두 가능하며, in vivo, in vitro test 모두 가능하다는 장점이 있다. 또한 생물 노출기간이 짧고 생물 반응결과가 민감하기 때문에 향후 증가된 이산화탄소로 인한 해양 생태계의 변화와 피해를 예측하는 지표로써 활용 가능할 것으로 사료된다.