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시험물질은 해양생물에 대한 높은 독성 민감도, 물리적 거동, 해양산업시설 배출수 내 검출빈도 등을 기준으로, 중금속, VOCs, 기타물질 중 각 우선순위를 정하여 선정하였다. 중금속인 Copper, Nickel은 해양생물에서 높은 독성 민감도를 나타냈으며(Hwang et al.[2014]), 휘발성 물질인 2-propanol은 해수에서 용존형태를 띄는 특성을 나타내었고, Phenol과 함께 실태조사 결과 높은 출현빈도를 나타내 Copper, Nickel, 2-propanol, Phenol을 시험물질로 선정하였다(KRISO[2021]).

Phenol, 2-propanol은 고농도의 해수 stock solution을 제조하였으며, 중금속인 Copper, Nickel의 경우 Nitric acid에 녹여 1,000 mg/L 농도의 표준용액을 사용하였다. 시험에 사용된 물질은 99 % 이상의 고순도 표준물질(Sigma-Aldrich, Merck, USA)을 이용하였으며, 멸균여과 해수(1μm membrane filter, Chisso Filter, Japan) 또는 인공해수(Synthetic seawater; ISO 10253)에 희석하여 시험농도를 제조하였다. 농도 구간 설정을 위해 Dilution factor의 기준을 0.5로 설정하였으며, 농도 범위 설정시험(Range finding test; EPA[2002])을 수행하여 본 시험에 적합한 농도 구간을 설정하였다.

시험 대상종은 국내에서 서식하고 있으며, 국내·외 표준시험법의 표준 시험종이거나 대상종에 대한 생태·생리학적 연구가 많이 진행되고, 쉽게 확보할 수 있으며 실내 사육이 용이하고, 독성 민감도가 높은 해양생물 10종을 선정하였다. 식물플랑크톤 시험종은 국제표준인 ISO 10253[2016]와 ASTM E1218-04[2012]에서 제시하는 Skeletonema sp.(해산 규조류), Dunaliella tertiolecta(해산 녹조류)를 선정하였고, 무척추동물 및 해조류는 ASTM E1440-91[2012], Snell et al.[1991]과 해양환경공정시험기준(MOF[2021a])에서 제시하는 Brachionus plicatilis(해산 로티퍼), Monocorophium acherusicum(저서성 단각류), Crassostrea gigas(참굴), Strongylocentrotus nudus(둥근성게), Saccharina japonica(다시마), Undaria pinnatifida(미역)을 선정하였다. 어류는 경제적 가치가 높고, 인공산란이 가능한 Epinephelus akaara(붉바리), Paralichthys olivaceus(넙치)를 선정하였으며, 표준시험법이 존재하지 않아 OECD 212[1998]를 참고하여 시험하였다. 시험표준에서 제시하는 유효기준(Validation of criteria) 설정하였으며, 충족하지 못할 경우 재시험을 수행하였다(Table 1).

시험용액은 시험시작과 종료 시를 포함하여 매 24시간마다 pH·DO 측정기(STAR A126, Thermo Fisher Scientific, USA)와 염분측정기(Pro30, YSI, USA)를 이용하여 pH, DO, 수온 및 염분 등을 측정하였다.

무영향관찰농도(No Observed Effect Concentration, NOEC), 최소 영향관찰농도(Lowest Observed Effect Concentration, LOEC)의 산출을 위해서 식물플랑크톤의 성장저해율, 무척추동물의 생존율, 해조류의 발아율, 어류의 생존율 결과를 이용하였다. 대조구와 시험구들 사이에 유의한 차이의 유무를 확인하기 위하여 ANOVA(Analysis of variance)를 이용하였고 정규성 검정(Shapiro Wilk's test), 분산의 동질성 평가(Bartlett’s test) 후 유의수준 5%에서 분석하였다. 사후검정으로 Dunnett’s test를 수행하였으며, 비모수의 경우 Steel’s many-one rank test를 이용하여 분석하였다.

반수영향농도(50% Effect Concentration, EC₅₀)와 반수치사농도(50% Lethal Concentration, LC₅₀)는 선형보간법(Linear interpolation)과 Maximum Likelihood-Probit을 이용하여 산출하였다. 모든 가설검정(Hypothesis test) 및 점추정(Point estimate)의 통계분석은 TOXCALC 5.0 program (Tidepool scientific software, USA)를 이용하였다.

Copper, Nickel, 2-propanol, Phenol을 대상으로 독성시험을 수행한 결과, Copper>Nickel>Phenol>2-propanol 순으로 민감한 영향을 나타냈다(Table 2). 국외종을 대상으로 한 선행 독성시험에서도 동일한 물질순으로 독성 민감도를 나타내 본 연구결과와 부합하였다(Table 3). 독성시험 결과 가장 민감한 영향을 나타낸 시험은 Copper의 U. pinnatifida 아포체 성장률 시험으로 NOEC, LOEC 및 EC₅₀ 값이 각각 0.02, 0.03 및 0.1 mg/L로 나타났으며, 2-propanol의 P. olivaceus 수정란 생존율 시험은 NOEC, LOEC 및 LC₅₀ 값이 각각 1,000, 2,000 및 6,216 mg/L로 나타나 가장 낮은 민감도를 나타냈다. 96시간의 수정란 생존율 시험보다 96시간의 개체군 성장률을 시험 종말점으로 설정한 만성독성시험이 더욱 민감한 영향을 나타낸 것으로 판단된다.

표준에서 제시하는 유효기준은 모두 만족하여, 시험 노출 초기 및 종료시 pH 변화는 최대 1을 초과하지 않았으며 온도는 ± 2℃, 염분은 ± 1 PSU 범위를 나타내 시험조건의 높은 안정도 내에서 시험이 수행되었다.

Copper의 독성시험 결과, 전체 시험종에서 반수영향농도가 가장 높으며 낮은 민감도를 나타낸 생물은 식물플랑크톤 D. tertiolecta 및 Skeletonema sp.로 NOEC, LOEC 및 EC₅₀₍₁₀₎ 값이 각각 1.3, 2.5 및 4.2(2.7) mg/L와 0.4, 0.8 및 1.5(0.9) mg/L로 나타났다(Table 2). 식물플랑크톤은 어류, 무척추동물 개체군에 비해 일반적으로 민감한 반응을 나타내는 생물로 알려져 있으나(Kim et al.[2018b]; Frampton et al.[2006]), Copper를 이용한 본 시험에서는 가장 낮은 민감도를 나타냈다. Copper의 경우 식물플랑크톤의 필수 미량원소로 이용되며(Hwang et al.[2014]), 무척추동물(두족류, 복족류 등)의 호흡색소인 헤모시아닌에 매우 높은 농도로 존재하여(MOF[2015b]) 흡수율 또한 높아, 식물플랑크톤에서 낮은 민감도와 무척추동물에서 높은 민감도를 나타낸 것으로 판단된다.

Nickel의 NOEC, LOEC 및 EC₅₀₍₁₀₎ 값의 범위는 각각 0.1~1.0, 0.2~5.0 및 1.0~7.1(0.2~4.2) mg/L로 나타났다. 식물플랑크톤 성장저해시험 결과 EC₅₀값이 1.0~3.0 mg/L로 나타났으며, 해산 식물플랑크톤 Thalassiosira sp.를 이용한 선행연구 결과 0.1~10 mg/L로 나타났다(Wilson and Freeberg[1980]). 이러한 차이는 시험종의 민감도 및 시험기간, 방법 등의 차이로 판단된다.

2-propanol의 NOEC, LOEC 및 EC₅₀₍₁₀₎ 값의 범위는 각각 100~2,000, 500~4,000 및 3,018~7,710(676~3,591) mg/L로 나타났다. ECHA(The European Chemicals Agency)의 독성 정보(Ecotoxicological information)에서도 급·만성 NOEC값을 1,000 mg/L 초과로 평가하고 있으며, 수중 독성에 대한 영향은 매우 낮은 것으로 판단된다. Phenol의 NOEC, LOEC 및 EC₅₀₍₁₀₎ 값의 범위는 각각 6.25~25.0, 12.5~50.0 및 20.8~125.5(4.5~52.7) mg/L로 나타났다.

Copper를 제외한 모든 물질에서 식물플랑크톤 또는 해조류 독성시험이 가장 민감한 반응을 나타냈으며, 어류 독성시험에서 가장 둔감한 반응을 나타냈다. 화학물질의 독성은 일반적으로 식물플랑크톤, 해조류>무척추동물>어류 개체군 순으로 민감한 영향을 나타내지만, 물질에 반응하는 생물종의 특성과 시험조건, 방법에 따라 다르게 나타나기도 한다(Lee et al.[2008]; Wu et al.[2016]).

만성독성시험의 기준은 종말점과 시험기간, 종의 민감도 등으로 평가하고 있으며(EPA[2001]), 본 시험에서는 B. plicatilis의 96시간 개체군 성장률 시험, U. pinnatifida의 21일 아포체 성장률시험, 식물플랑크톤의 72시간 성장저해시험이 만성시험으로 고려된다. 식물플랑크톤 성장저해시험은 다른 시험종과 비교하여 시험기간이 짧지만, 생애 전 단계를 모두 포함하는 지수성장기를 거치고, 민감하고 취약한 종말점을 포함하여 만성으로 허용되고 있다(IMO[2017]).

식물플랑크톤에서 낮은 민감도를 나타낸 Copper를 제외한 급성 및 만성 평균 독성값(E(L)C₅₀)은 Nickel에서 각각 5.7 및 2.9 mg/L, 2-propanol에서 6,674 및 4,978 mg/L, Phenol에서 75.0 및 35.8 mg/L로 나타나 만성시험에서 급성시험 보다 높은 민감도를 나타냈다(t-test, 1-tail, <0.05). 만성독성은 생물의 가장 취약한 단계의 독성영향을 검출할 수 있으며, 만성독성 데이터의 확보는 독성값의 불확실성을 줄이고, 신뢰성을 높일 수 있다. 그러나 만성독성시험은 시험기간이 비교적 길고, 시험조건 및 유효성을 확보하기 어려워 국내·외 해수종 만성 독성자료값이 매우 부족한 실정이며 물질에 따라 자료에 부재시 기본값 또는 추정치가 적용되고 있다. 따라서, 민감도가 높고 만성적인 시험이 가능한 국내 해양 독성 시험종 확보와 다양한 노출기간 등을 고려한 독성시험 수행이 필요할 것으로 판단된다.

시험물질의 독성시험결과를 바탕으로 종민감도분포와 HC₅를 산출하였다. 국립환경과학원의 화학물질 위해성평가의 구체적 방법 등에 관한 규정에 따르면 최소 4개의 분류군과 5종 이상의 독성자료가 충족되어야 한다(NIER[2020]). 본 시험에서는 4개의 분류군과 10종의 국내종 독성시험을 수행하였다. 국외종 독성자료는 ECOTOX database (EPA[2022b])에서 식물플랑크톤, 무척추동물, 연체동물, 어류별로 종말점(생존, 성장, 부화 등)과 독성값이 명확하고, 만성값을 우선하여 신뢰할 수 있는 15종 이상의 독성값 자료를 확보하였으나, 2-propanol의 독성자료는 무척추동물 3종의 독성값만 존재하여 SSD 산출은 수행할 수 없었다(Table 4).

종민감도분포곡선의 정규성검정(Anderson-Darling, Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises test)은 모두 적합하였으며(p>0.05), 적합모델은 Anderson and Burnham[2002]에 따라 Akaike’s Information Criterion corrected for sample size (aicc) value가 가장 작고, Delta value가 0에 수렴하는 모델인 log-normal distribution (Copper), gamma distribution (Nickel, Phenol) 및 log-logis (2-propanol)을 선택하였다(Table 4).

국내종을 이용한 독성시험 결과를 토대로 Copper의 HC₅는 0.04(0.01~0.16) mg/L이며, Nickel은 1.66(0.9~3.2) mg/L, 2-propanol은 3,981(3,155~5,193) mg/L, Phenol은 16.3(8.2~35.0) mg/L로 나타났다(Fig. 1). 국외종 독성자료의 결과를 토대로 Copper의 HC₅값은 0.02(0.01~0.05) mg/L이며, Nickel은 0.38(0.07~3.5) mg/L, Phenol은 8.9(4.2~20.6) mg/L로 나타나 국내종 HC₅ 결과와 다소 차이를 나타냈다(Table 3). 미국의 해양생물 만성 독성값을 적용한 수생생물 보호 준거치 CCC (Criterion Continuous Concentration)는 Copper의 경우 0.0031 mg/L, Nickel은 0.0082 mg/L 로 본 연구에서 제시한 확률론적 PNEC 보다 엄격한 기준으로 나타났으며 생물의 민감도 차이, 만성 독성값의 부족 등으로 인한 것으로 판단된다. Phenol과 2-propanol은 독성자료의 부족과 인체 위해성의 중요성 등으로 인체 준거치만 제시되어 있다(EPA [2022d]).

Fig. 1. 
Illustration of SSDs derived from three approaches (Log-logis, Log-normal, Gamma).

Skeletonema sp. (Cowgill et al.[1989]), D. tertiolecta (Peterson and Stauber[1996]), B. plicatilis (Snell et al.[1991])은 국내종과 같은 종을 사용했음에도 시험기간, 시험실 조건, 배양환경 등의 영향으로 결과에 차이가 나타난 것으로 판단된다. 시험종의 민감도 및 신뢰성 확보를 위해 수행하는 물질별 참조물질독성시험(Reference toxicant test) 데이터 구축과 시험소 간 비교시험 등이 국내종 대상으로는 수행되고 있지 않지만, EPA의 국외종(Americamysis bahia, Cyprinodon variegatus, Menidia beryllina 등)의 경우 최소 20개 기관이 참여하여 종별 민감도와 변동성을 확인하고 데이터를 구축하고 있다(EPA[2001]). 국내종 독성값의 신뢰성을 확보하기 위해 국외에서 시행되고 있는 민감도시험 및 시험소 간 비교 시험 등이 수행되어야 할 것이다.

해양생물에게 영향이 미치지 않는 안전한 농도의 한계치인 예측무영향농도(PNEC)를 산출하였다. 결정론적 방법은 독성자료 중 가장 민감한 값을 선정하였고, 확률론적 방법은 HC₅를 활용하였다. 불확실성을 고려하여 보수적인 안전계수(Assessment factor)를 활용하였으며 결정론적 방법에는 100, 확률론적 방법에는 5를 적용하였다(IMO[2017]; EC[2003]).

본 연구에서 결정론적 방법을 통해 도출된 PNEC 값이 Copper에서 0.0009 mg/L, Nickel에서 0.01 mg/L로 해양환경기준의 해양생태계 보호 단기기준인 0.003 mg/L (Copper), 0.011 mg/L (Nickel)과 비교하여도 유사하거나 낮은 수준으로 도출되었으며, 확률론적 방법에 비해 모두 10배 이상 낮은 값이 도출되었다. 결정론적 방법은 단일 생물종과 제한된 자료로 인하여 불확실성이 높아 독성기준 및 배출기준 준거치로 활용하기에 제한적이며, 확률론적 방법에서는 신뢰성이 높고 충분한 독성자료가 필요할 것으로 판단된다.