본 연구에서는 강원도 고성 앞바다의 해안가로부터 약 3 km, 해수면으로부터 약 300 m 지점에서 취수한 해양심층수를 사용하여 실험을 수행하였다. 사용한 해양심층수의 초기 염도는 3.4 wt%이며, 역삼투 공정과 감압증발공정을 걸쳐 마그네슘염을 추출하였으며, 제조한 미네랄추출물은 해양수산부 고시 제 2015-112호 ‘해양심층수 미네랄추출물의 정의, 원료기준, 제조·가공기준, 제품규격 및 시험방법’에 적합하며, 미네랄추출물의 정보는 Table 1과 같다.

독성시험은 GLP인증기관인 ㈜크로엔에서 진행하였으며, 시험군으로 Sprague-Dawley 랫드를 사용하였다. 랫드는 다양한 종류의 물질에 대한 독성을 평가하는데 널리 사용되고 있으며, 풍부한 시험 기초자료가 있으므로 본 시험의 실험동물로 선택하였다. 시험물질대조군(0 mg/kg), 1,250 mg/kg, 2,500 mg/kg 및 5,000 mg/kg 을 투여하는 시험물질 투여군과 부형제를 투여하는 대조군을 설정하였고, 각 군당 암수 5 마리를 사용하였다(Table 2참조). 관찰항목으로는 시험물질을 투여한 후 14 일간의 사망률, 일반증상, 체중변화 및 부검소견을 관찰 하였다(NIFDS[2019]).

랫드의 검역은 입수 시 모든 동물의 수와 상태를 관찰하였고, 동물공급업체에서 제공한 검사성적서 등을 시험 기초자료로 보관하였다. 모든 동물은 동물실 환경에 적응하기 위해 9일의 순화기간을 두었다. 순화기간 동안 모든 동물은 매일 1 회 순화기간 증상을 관찰하였으며, 순화기간 중 건강한 개체로 판정한 동물의 체중을 측정하고, 평균체중에서 벗어난 동물은 제외하였다. 선택한 동물들은 순위화한 체중에 따라 각 군의 평균체중이 최대한 균일하게 분포되도록 지그재그로 분배하여 군 분리 하였다. 잔여동물은 군 분리종료 후 시험계로부터 제외시켰으며, 이후 해당 SOP에 따라 처리하였다. 랫드는 Table 3와 같은 사육환경에서 관리 하였다.

본 시험에서는 식품임을 감안하여 의약품 단회 투여 독성시험의 한계용량인 2,000 mg/kg 보다 높은 5,000 mg/kg을 고용량군으로 설정하고 아래로 2,500 mg/kg, 1,250 mg/kg, 대조군 0 mg/kg을 포함하여 총 4개 군을 설정하였다. 그리고, 대조군은 해양심층수 미네랄 추출물의 독성 비교를 위하여 설정하였으며, 시험군 및 투여량은 Table 4과 같이 설정하였다.

투여경로는 임상 예정경로인 경구 투여를 선택하였으며, 총 투여량을 1 회/일, 15:00 이전에 투여 하였다. 투여액량은 10 mL/kg으로 하고, 개체별 투여액량은 절식 후 투여당일의 체중을 기준으로 산출하였다. 투여 전에 음수는 자유섭취 시키면서 약 12 시간 이상 절식시켰다. 시험물질은 경구투여용 존데를 부착한 일회용 주사기로 위 내에 강제투여 하였으며, 첫 투여 후 약 3~4 시간 후에 사료를 공급하였다. 투여당일(0 일)에 첫 투여 후 30 분까지는 적어도 1회 이상, 1, 2, 3 및 4 시간 에 일반상태(독성징후의 종류, 발현시기, 회복시기 등) 및 사망유무를 관찰하였다.

투여 후 1 일부터 14 일까지는 매일 1 회 일반증상을 관찰하였으며, 체중은 전자저울(GF-2000, AND, Korea)을 사용하여 동물입수 시, 군 분리 시, 투여당일(투여 전), 투여 후 1, 3, 7 일 및 14 일(부검일)에 측정하였다. 관찰기간 종료 후, 모든 생존동물에 대해서 CO2 가스를 흡입 시켜 후대정맥/복대동맥에서 방혈 하여 안락사 시키고 부검하여 육안적으로 모든 장기를 검사하였다. 또한 체중은 일원배치 분산분석(One-way ANOVA test)으로 군간 비교하고, P<0.05인 경우 통계학적으로 유의하다고 판정하였다. 통계학적 분석은 상용으로 널리 사용되고 있는 통계 패키지인 SPSS(IBM SPSS Statistics, ver. 24)를 이용하여 실시하며, P<0.05인 경우 통계적으로 유의하다고 판정하였다.

시험결과 모든 시험군에서 사망개체가 관찰되지 않았다. 그리고 일반증상 관찰 시 수컷의 고농도 시험물질 투여군인 5,000 mg/kg 에서 시험물질 투여 후 0.5 시간, 1 시간, 2 시간에 한 마리에게서 복와위(prone position), 창백(paleness), 저체온증(hypothermia)이 관찰되었으며, 3 시간과 4 시간에는 2 마리에게서 자발운동의 저하(decrease of locomotor activity)가 관찰되었다. 또한 시험물질 투여 후 1일, 2 일에는 자발운동의 저하가 관찰되었고 3 일에는 사료섭취량의 감소가 관찰되었다(Table 4). 암컷의 고농도 시험물질 투여군인 5,000 mg/kg에서 시험물질 투여 후 0.5 시간과 1 시간에 한 마리에게서 자발운동의 저하가 관찰되었고, 투여 후 3 시간과 4 시간에 3 마리에게서 자발운동의 저하가 관찰되었으며. 시험물질 투여 후 1 일에 한 마리에게서 자발운동의 저하가 관찰되었다(Table 5).

부형제를 투여한 모든 대조군에서는 임상증상이 관찰되지 않았다. 체중변화는 암수 시험물질 투여군 체중이 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이가 없었으며, 부검결과도 Table 6와 같이 암수 모두에서 이상소견 관찰되지 않았다.