본 연구에서는 강원도 고성 앞바다의 해안가로부터 약 3 km, 해수면으로부터 약 300 m 지점에서 취수한 해양심층수를 사용하여 실험을 수행하였다. 사용한 해양심층수의 초기 염도는 3.4 wt%이며, 역삼투 공정과 감압증발공정을 걸쳐서 순도 79%의 해양심층수 미네랄추출물의 마그네슘염을 추출하였다(Table 1).

독성시험은 GLP인증기관인 ㈜바이오톡스텍에서 진행하였으며, 시험군으로 비글견을 사용하였다. 비글견은 동물실험용으로 생산되었고, 의약품 등의 안전성시험에 널리 사용되고 있으며, 비교할 시험 기초자료가 풍부하여 본 시험의 실험동물로 선택하였다. 대조군은 암수 각 1 마리, 시험물질군은 암수 각 2 마리의 비글견을 이용하여 시험물질인 해양심층수 미네랄추출물을 4 일 간격으로 용량을 변경하여 단회 경구투여 시 나타나는 독성반응을 평가하기 위하여 실시하였다(Table 2).

시험은 “비임상시험관리기준” 식품의약품안전처 고시 제 2017-32 호, “의약품등의 독성시험기준” 식품의약품안전처 고시 제 2015-82 호에 근거하여 실시하였으며, 동물보호법(제정 1991년 5월 31일 법률제 4379 호, 일부개정 2015년 1월 20 일 법률 제 13023호)을 근거한 ㈜바이오톡스텍의 동물실험윤리위원회에 의해 승인되었다(승인번호: 170294). 시험물질을 전자저울 (BP3100S, ENTRIS423i-IS, Sartorius, Germany)로 칭량하여 조제용기에 넣고, 일정량의 부형제를 첨가하여 용해시킨 다음, 다시 부형제를 가하여 설정농도로 맞추었으며, 매번 투여당일 조제하였으며, 비글견은 Table 3와 같은 환경에서 관리하였다.

모든 비글견은 입수 시 문신번호를 확인하고, 일반상태, 체중(HW-100KGV, A&D Co., Ltd) 및 체온을 측정하였다. 입수 후 19 일간의 검역·순화기간 중 매일 1 회 일반증상을 관찰하고, 주 1 회 체중을 측정하였으며, 검역·순화기간 종료 시에 동물의 건강상태를 확인하였으며 별다른 특이사항은 없었다. 사육 상자에는 개체식별카드를 부착하고, 동물은 문신번호로 식별하였다. 검역·순화기간 종료 후, 체중을 기초로 하여 대조군은 암수 각 1 마리, 시험물질투여군은 암수 각 2 마리로 군분리 하였다. 사료는 Cargill Agri Purina Inc.에서 제공한 사용 로트의 분석성적서를 확인한 결과 허용범위 내에 속하였으며, 고형사료를 마리당 약 250 g 씩 1 일 1 회 공급하였고, 매번 투여 시 및 부검 시에는 그 전날의 16:00 ~ 17:00 사이부터 절식시켰다. 음수는 청주시 수돗물을 필터유수살균기로 여과 후 자외선을 조사한 정제수를 자동급수장치를 이용하여 자유섭취 시켰다. 음수의 분석은 충청북도 보건환경연구원에 의뢰하여「먹는물 수질기준 및 검사 등에 관한 규칙」(환경부령 제 684 호, 2016 년 12 월 30 일, 타법개정)의 전 항목에 대한 검사를 1 회/년, 미생물 검사는 1 회/월 실시 한다. 시험물질의 투여방법은 임상적용 예정경로가 경구이므로 경구경로를 선택하였으며, 개체별 투여액량은 투여당일의 체중을 기준으로 산출하고, 경구투여용 카테터를 부착한 일회용 주사기(50 mL)를 이용하여 위내에 강제 투여하였으며, 투여하고 약 2시간 후에 사료를 공급하였다. 또한, 4 일 간격으로 용량을 증가하여 총 4 회 투여하였다.

본 시험에서는 1,250 mg/kg을 1 차 투여용량으로 설정하고, 2,500 및 5,000 mg/kg 을 2 및 3 차의 투여용량으로 설정하여 1 및 2 차 투여 후 구토가 비교적 심하게 나타나 다시 300 및 600 mg/kg을 3 및 4 차의 투여용량으로 설정하였다. 대조군에는 시험물질군과 동일한 액량의 부형제를 투여하였으며, 군구성 및 투여량은 Table 4과 같이 설정하였다.

매번 투여당일에는 투여 후 약 30 분간 및 1, 2, 4, 6 시간에 일반상태, 운동성 및 배설물 등에 대한 일반증상을 관찰하였다. 그 다음날부터는 1 일 2 회 이상 관찰하고, 빈사나 사망동물의 유무를 확인하였으며, 최종투여 후 2주간 관찰하였다. 실험기간 중, 암수 모두에서 사망동물은 발생하지 않았으나, 1 차 1,250 mg/kg 투여 후, 약 5~10 분 사이에 모든 개체에서 구토 (vomiting)가 발생하고, 2 차 2,500 mg/kg 투여 후에도 약 5 분 이내에 모든 개체에서 구토가 발생하였으며, 암컷 1 례(개체번호: 2202)에서는 약 6 시간에 설사(diarrhea)가 관찰되었다. 따라서, 3 차는 용량을 낮추어 300 mg/kg 투여 후, 수컷은 2 례 모두 약 4 시간에 경도의 설사가 관찰되고, 암컷은 1 례(개체번회: 2201)에서 약 1 시간에 경도의 설사가 관찰 되었다. 4 차 600 mg/kg 투여 후, 암수 모두 약 5~10 분 사이에 구토가 발생하였으며, 암컷의 1 례(개체번호: 2201)에서는 약 2 시간에는 설사가 관찰되었다. 상기 600 mg/kg 이상의 용량에서 관찰된 비교적 심한 구토증상은 시험물질의 투여에 의한 영향으로 사료되며, 그 외, 경도로 관찰된 설사증상은 용량의존성이나 일관성이 없어 독성학적 의미는 미미한 것으로 판단된다(Table 5).

체중에서는 암수 모두 시험물질의 투여에 의한 변화는 관찰되지 않았다(Table 6). 부검에서는 암수 대조군을 포함한 모든 동물에서 어떠한 이상소견도 관찰되지 않았다.